La prima sede fu costituita dalla vecchia prigione seicentesca delle Carceri Nuove di via Giulia, fatta costruire da Papa Innocenzo X e che rappresentò il fiore all'occhiello della politica penitenziaria dello Stato Pontificio.

Il museo si articolava in varie sezioni: sezione del delitto (con reperti relativi a diverse tipologie di reati, dal falso all'omicidio) - attività statale contro i delinquenti (con la rappresentazione delle tecniche investigative) - esecuzione delle pene e delle misure di sicurezza (oggetti provenienti dalle carceri definiti in maniera suggestiva "malizie carcerarie", ovvero sotterfugi inventati dai detenuti per occultare armi, per evadere, per compiere atti di autolesionismo) e infine una sezione storica contenente bandi ed editti, strumenti di tortura e di esecuzione capitale.

Nel 1968 il Museo Criminale fu smantellato per destinare i locali delle Carceri Nuove ad altro uso, e dal 1975 è ospitato nel Palazzo del Gonfalone, edificio risalente al 1827, fatto costruire da Papa Leone XII per destinarlo a casa di correzione dei giovani minorenni provenienti dal carcere clementino collocato presso l’ospizio apostolico di San Michele.

Il Museo Criminologico costituisce una preziosa testimonianza storica sui sistemi punitivi del passato e uno strumento didattico per le scuole e gli istituti di formazione.